Nel 286 d.C. l'imperatore Massimiano fece di Milano la capitale dell'Impero Romano d'Occidente, cingendola in  una cerchia di mura che comprendeva sia la città gallica che la città romana. Manterrà tale titolo fino al 402 d.C., anno in cui Ravenna prenderà il suo posto.

Nel 313 d.C. l'imperatore Costantino emanò a Milano l’Editto di Costantino che poneva fine alle persecuzioni contro i Cristiani e rendeva Milano uno dei centri cristiani più importanti dell’Europa Occidentale.

Nel periodo che seguì la città raggiunse il massimo splendore sotto la guida di uno dei più grandi personaggi della sua storia: Sant'Ambrogio, nominato vescovo della città nel 374 d.C.  e istitutore del rito Ambrosiano, tuttora diverso dal rito Romano in uso.

Perduta la posizione di capitale, la città conservò ed accrebbe quella di metropoli religiosa, e i vescovi successori di Sant'Ambrogio (morto nel 397 d.C.) vi acquistarono crescente autorità e prestigio anche in campo civile.

All'inizio del V secolo, inizia anche per Milano il tormentoso periodo delle invasioni barbariche.

Nel 402 d.C. i Visigoti, comandati dal re Alarico, assediano la città che resiste e riesce a respingerli. Questo fatto induce l'imperatore a lasciare Milano e a scegliere Ravenna come località più adatta alla difesa e come nuova capitale dell'Impero.

Comincia così un'era di decadenza che si aggrava quando Attila, re degli Unni, devasta e saccheggia la città nel 452 d.C.

Venne occupata dagli Eruli di Odoacre nel 476 d.C. e dagli Ostrogoti di Teodorico nel 489 d.C. Nel 539 d.C. tornarono gli Ostrogoti, guidati da Vitige, che assediarono la città e, dopo due anni, la costrinsero alla resa, distruggendola quasi completamente: Milano fu ridotta ad un mucchio di rovine, mentre nuovi centri acquistano importanza: Pavia e Monza.